產(chǎn)品詳情
Steady Firefly Luciferase reporter Assay Kit
貨號 |
規(guī)格 |
Luc-10 |
10毫升 |
Luc-100 |
100毫升 |
產(chǎn)品原理:
螢火蟲熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Firefly Luciferase Reporter Gene Assay Kit),是一種以熒光素(luciferin,也稱螢光素)為底物, 檢測熒光素酶(firefly luciferase, 也稱螢光素酶)活性的試劑盒。螢火蟲熒光素酶是一種分子量約為61 KD的蛋白,在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下, 可以催 化luciferin氧化成oxyluciferin。在luciferin氧化的過程中,會發(fā)出生物發(fā)光(bioluminescence)。生物發(fā)光可以通過化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或液閃測定儀進行測定。
通過熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系,可以非常靈敏、高效地檢測基因的表達。通常把所研究基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或 5’啟動子區(qū)克隆在luciferase基因的上游,或把3’-UTR區(qū)克隆在luciferase基因的下游, 構(gòu)建成報告基因(reporter gene)質(zhì)粒,然后轉(zhuǎn)染細胞,用適當(dāng)方法處理細胞后,測定熒光素酶的活性。通過熒光素酶活性的高低,來判斷處理方法對目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。
穩(wěn)定型螢火蟲熒光素酶報告基因檢測試劑盒可以保持信號值長時間穩(wěn)定,非常適合高通量篩選的要求。
保存條件:
-20oC避光保存6個月有效,-80oC避光保存,一年有效。盡量避免反復(fù)凍融。
穩(wěn)定型螢火蟲熒光素酶報告基因檢測試劑盒使用方法:
1、 室溫下融解,同時將培養(yǎng)好的細胞從培養(yǎng)箱中取出,在二者都達到室溫且溫度一致時,開始下一步實驗;
2、 向細胞加入與培養(yǎng)基等體積的穩(wěn)定型熒光素酶檢測試劑,并在室溫下平緩振搖孵育至少5分鐘,以使細胞充分裂解,此過程可以用錫箔紙覆蓋避光。不論細胞培養(yǎng)在何種器皿中,加入與培養(yǎng)基等體積的熒光素酶檢測試劑即可;
3、 開啟化學(xué)發(fā)光儀或具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標(biāo)儀,設(shè)置適當(dāng)參數(shù);
4、 進行讀數(shù),可以直接在96孔板或384孔板中讀數(shù),也可以吸出100-200微升到發(fā)光管中進行讀數(shù)。本產(chǎn)品信號值非常穩(wěn)定,半衰期大于5小時,可達到高通量篩選的要求。
熒光素酶報告基因的主要優(yōu)點:
報告基因 |
優(yōu)點 |
缺點 |
熒光素酶 |
優(yōu)越的靈敏度 |
需要底物 |
高信號值 |
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無內(nèi)源活性 |
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β-gal |
靈敏度好 |
細菌,血清等內(nèi)源活性高 |
需要底物 |
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GUS(葡糖醛酸糖苷酶) |
靈敏度好 |
90% 的 E.coli, 人/動物細胞中有內(nèi)源活性 |
植物中內(nèi)源活性低 |
酶的擴散可引起 “過度報告” |
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需要底物 |
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SEAP(分泌性堿性磷酸酶) |
分泌性報告基因 (不需裂解) |
在 HeLa ,癌和其它細胞類型中有高的內(nèi)源活性 |
需要底物 |
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CAT(氯霉素轉(zhuǎn)乙酰基酶) |
真核細胞沒有背景表達 |
放射性的 |
易于使用 |
靈敏度底 |
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設(shè)備現(xiàn)成(液閃儀,層析) |
50h半衰期 |
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GFP(綠色熒光蛋白) |
顯微鏡: 亞細胞定位 |
背景可能高 |
不需底物 |
折疊 “情形” 可導(dǎo)致信號差別 |
穩(wěn)定型螢火蟲熒光素酶報告基因檢測試劑盒的優(yōu)點
1、 靈敏度高,最低可檢測10‐20摩爾熒光素酶分子,比Western Blot靈敏度高1000倍以上;
2、 檢測范圍廣,在10-16 M(10 pg/L)至10-8 M(1 mg/L)范圍內(nèi),光強度與熒光素酶濃度成正比;
3、 發(fā)光檢測,檢測方便,內(nèi)源性低,哺乳動物無內(nèi)源性表達,熒光素酶檢測不受細胞內(nèi)其他物質(zhì)影響;
4、 試劑盒成分經(jīng)過優(yōu)化處理,可以使信號值保持長時間穩(wěn)定,半衰期大于5小時,非常適合高通量篩選的要求。
主要應(yīng)用領(lǐng)域
1、啟動子核心區(qū)域檢測,增強子/抑制子等調(diào)控子核心元件檢測;
2、啟動子/增強子與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用,啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點檢測;
3、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究;
4、病毒/細胞相互作用;
5、藥物等化學(xué)誘導(dǎo)因素或射線等物理誘導(dǎo)因素對啟動子活性的調(diào)節(jié)(抑制或增強)。
注意事項:
1、 常見培養(yǎng)基如RPMI1640、DMEM、F-12、MEM等,以及酚紅、血清、PBS和其他緩沖液等,都不影響熒光素酶檢測試劑的使用。穩(wěn)定型熒光素酶檢測試劑經(jīng)過成分優(yōu)化處理,可使信號值保持穩(wěn)定,半衰期大于5小時,非常適合高通量篩選的要求。
2、 由于溫度對酶反應(yīng)有影響,所以樣品和試劑均需達到室溫后再進行測定。
3、 為保證熒光素酶檢測試劑的穩(wěn)定,可以采取適當(dāng)分裝后避光保存的方法,以避免反復(fù)凍融和長時間暴露于室溫;經(jīng)測試,反復(fù)凍融三次,對測定結(jié)果無明顯影響。
4、 細胞如果在96孔或384孔板中直接讀數(shù),需要使用白色或黑色不透明的培養(yǎng)板,以免發(fā)生孔與孔之間的信號干擾。
5、 為避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)細胞時效率的差異而帶來的誤差,可以同時轉(zhuǎn)入海腎熒光素酶(Renilla luciferase)的報告基因質(zhì)?;颚?半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-gal)的報告基因質(zhì)粒等作為內(nèi)參。
6、 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)。為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
常見問題:
1、 Luminometer和熒光分光光度計有何不同? 熒光分光光度計檢測的樣品本身不能發(fā)光,樣品需要由特定波長的激發(fā)光激發(fā),然后才能產(chǎn)生熒光并被熒光分光光度計檢 測。Luminometer檢測的樣品本身可以發(fā)光,不需要激發(fā)光進行激發(fā)。也就是說luminometer是檢測化學(xué)發(fā)光(螢光)的儀器。有些型號的熒光分光光度計也具有l(wèi)uminometer的功能,即也可以檢測化學(xué)發(fā)光。您所使用的熒光分光光度計能否用于化學(xué)發(fā)光的測定請仔細閱讀該儀器的說明書,或咨詢儀器供應(yīng)商。
2、 可以進行ATP化學(xué)發(fā)光檢測的儀器是否就可以用于本試劑盒的檢測? 是。ATP化學(xué)發(fā)光的檢測原理和本試劑盒的原理相同,可以用相同的儀器測定。